میکروبیولوژی , ... لینک اطلاعاتinformation link/microbiology
میکروبیولوژي - مبارزه بيولوژيک توسط Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis 

مقدمه:
مبارزه بیولوژیک با امراض و آفات نباتی پیشینه ای بسیار طولانی دارد.
از جنگ جهاني دوم به اين سو تا همين اواخر، راه و روش اصلي براي مبارزه با حشرات ناقل بيماري و آفات گياهي كابرد حشره كشها و در بياني عام آفت كشها بوده است.اما بعد از پي بردن به پايداري آنها در محيط و عوارض زيست محيطي و توانايي آنها در ايجاد مسموميت هاي مزمن در انسان و موجودات زنده، اين روش مورد انتقاد وسيع قرار گرفت و بحث مبارزه تلفيقي يعني كاربرد همزمان چند روش مبارزه بمنظور تشديد اثرات مثبت يكديگر و كاهش اثران منفي كاربرد انفرادي هريك از آنها در دستور كار قرار گرفت.مبارزه تلفيقي را اصطلاحا مديريت جامع آفات Integrated Pest Management يا اختصارا IPM مي نامند.يكي از اين روشهاي تلفيقي همانا مبارزه بيولوژيك Biologic Conntrol است.اين روش بر كابرد عوامل پاتوژن و دشمنان طبيعي آفات براي مبارزه با آنها استوار است.عوامل مورد استفاده مي تواند شامل ويروسها، باكتريها،تك ياخته ها، قارچها، گياهان، نماتودها و ماهياي لارو خوار گردد

باكتري خاكزي و غيربيماريزاي باسيلوس تورين ژينسيس Bacillus thuringiensis=BT سروتايپ H14 در فاز مرگ خود اگزوتوكسيني ترشح مي كند كه قابل جدا سازي است و براي سيستم گوارشي لارو برخي حشرات بويژه پشه ها سميت زيادي دارد ولي خوشبختانه براي گياهان، جانوران و انسان كاملا بي ضرر است. اكنون سم كريستال آن بصورت گرد قابل حل در آب يا امولوسيون با روش صنعتي و در مقادير انبوه و تحت عناوين تجاري مختلف از جمله Teknar و Baktimos توليد مي شود. ژنهاي كد كننده اين جزء سمي شناسايي و به ساير باكتريها منتقل شده است و تركيبات قويتري تهيه شده است.
كشور ما در اين زمينه بسار فعال است بطوريكه از سال ۱۳۶۳ در سازمان پژوهش هاي علمي و صنعتي، تحقيق در در اين مورد آغاز و سرانجام در سال ۱۳۶۸ خانم دكتر معظمي توانست در روستايي نزديك خرم آباد، اين باكتري را از لاروهاي مرده آنوفل استفنسي جدا نمايد و سم پپتيدي آن را پس از خالص سازي سنتز نمايد.اين محصول در ۱۵ دقيقه ۸۰ دررصد از لاروها را مي كشد.محيط كشت باكتري ملاس چغندر بوده بنابراين تكثير آن كم هزينه است.براي هر هكتار سطح آب ۵/۱ كيلوگرم سم لازم است.
خانم دكتر نسرين معظمي مدير گروه ميكربيولوژي دانشگاه تربيت مدرس و رئيس پژوهشكده بيوتكنولوژي ايران در جزيره قشم بوده و به پاس تلاشهاي زيادشان نشان درجه يك تحقيق كشوري را و نيز جوايز ارزشمند ديگري از مجامع بين المللي از جمله WHO دريافت كرده اند. مشكلاتي كه به وسيله استفاده بي رويه از سموم شيميايي براي انسان و محيط زيست به وجود مي آيد، ضرورت استفاده از روشهاي غيرشيميايي را افزايش مي دهد.
استفاده غيراصولي از سموم كشاورزي و اثر مخرب آن بر روي انسان و محيط زيست از جمله مسائل مهم امروز دنيا است كه در اين ميان مبارزه بيولوژيك نقش بسيار مهمي را در اين زمينه ايفا مي كند.
هر ساله با گسترش آفات در جهان به موازات آن مبارزه شيميايي توسعه پيدا مي كرد تا آنقدر افزايش پيدا كرد كه سطح مبارزه شيميايي در هرهكتار در چند نوبت رسيد كه انواع حشره كش
گرانول در آن اراضي مصرف شد .زماني كه مسئله بحث زيست محيطي مطرح شد و توجه مسئولان و كارشناسان را به خود جلب كرد كه حجم بيش از حد مصرف سموم با توجه به اكولوژي مناطق مي توانستمحیط زیست را تهديد كند به همين دليل بدین نتيجه رسيدند كه از ساير روشها به نحو مطلوب استفاده شود. يكي از اين روشها كه مي توانست آفت را كنترل كند مبارزه بيولوژيك بود.
چکیده مقاله:
باسیلوس تورین جینسیس(که با اصطلاحBtشناخته می شود) جزئء بیماری حشرات محسوب می گردد و در بازارهای جهانی جهت کنترل حشرات مضر گیاهان و آفات نباتی دادو ستد می شود و کاربرد دارد.
این باکتری بیشتر روی کاتر پیلارها اثر میگذارد ولی بر روی فلس بالان(پروانه ها و بیدها) و همچنین لارو حشراتی مانند پشه ((simullid black flide ناقل بیماری کوری رودخانه ای( blidness) در آفریقا تاثیر کشنده ای دارد.
Btدر حال حاضر درحدود یک/1 در صد از بازار مواد آفت کش کشاورزی (قارچ کشها_ علف کش ها و حشره کش ها) را در سراسر دنیا به خود اختصاص داده است.
محصولات تجاری BTبه صورت پودرهایی حاوی مخلوطی از اسپورهای خشک شده باکتری و کریستالهای سم آن تهیه می شوند.
این محصول برای استفاده روی برگها و قسمتهای دیگری از گیاه که خوراک لارو حشرات را تشکیل میدهند تهیه شده است و نکته جالب توجه دیگر آنکه ژنهای تولید کننده سم در باکتری را از طریق تکنیک مهندسی ژنتیک درون دانه های چندین نمونه از گیاهان مختلف قرارداده اند و از این طریق با آفت مبارزه می کنند. در این روش کنترل بیولوژیکی از ژنهای نشاندار شده BACILLUS POPILLIAC  جهت انتقال خاصیت تولید سم به گیاه میزبان آفت استفاده می کنند.
کریستالها از مجموعه ای از پروتئین های بزرگی (با وزن تقریبی 130 تا 140 کیلودالتون) که در واقع یک پروتوکسین می باشند تشکیل شده اند.  این پروتئینها برای آنکه بتوانند تاثیر خود را بگذارند باید فعال شوند در غیر اینصورت  هیچ اثری نخواهند داشت.
کریستالهای پروتئین از آنجاییکه بسیار نامحلول هستند  به طور کلی برای انسانها ،بیشتر حیوانات و اکثر حشرات بی ضرر هستند. هرچند در  PHبالا در حدود5/9 حلال می باشند در حالت عادی که سم به صورت کریستال نامحلول است  نیمی از قدرت خود را داشته و بسیار سریع غیرفعال می شوند وبدین علت تاثیری روی لارو فلس بالان نخواهند گذاشت.
اما در شرایط خاص یک عامل اختصاصی با قدرت حشره کشی بسیار بالا می باشد.
در دستگاه گوارش حشرات این سم قابلیت انحلال دارد و "پروتوکسین" ابتدا  توسط آنزیمهای پروتئاز گوارشی به سم فعال با وزن حدود 60 کیلو دالتون تجزیه میشود. این سم" دلتا – اندوتوکسین" مقاوم به حرارت است.
 
 نحوه عمل بر روی آفات:
با تشکیل N- باند سم با سلولهای اپیتلیال مجرای هاضمه منافذی در غشائ سلول پدیدار می گردد و بدین ترتیب تعادل یونی اطراف غشاء سلول برهم می خورد. درنتیجه شکم حشره سریعا بی تحرک شده و سلولهای اپیتلیال لیز می شوند . در این مرحله تغذیه لارو حشره متوقف می شود. همچنین PHمعده با PH خون به حالت موازنه در می آید که این کاهش PH در خون باعث می گردد تا اسپورهای باکتری شروع به جوانه زنی کرده و پس از رشد ، باکتری به میزبان تهاجم خود را آغاز میکند. بدین ترتیب یک "سپتی سمی"(گندخونی) کشنده تعمدی رخ می دهد.

 
 
 
Bacillus thuringiensis
 
Bacillus thuringiensis viewed by phase contrast microscopy. The vegetative cells contain
endospores (phase bright) and crystals of an insecticidal protein toxin (delta endotoxin). Most cells have lysed and released the spores and toxin crystals (the structures with a bipyramidal shape
 

























 ساختار اندوتوکسین دلتا:
مطالعات جدید برروی ساختار دلتا-اندوتوکسین نشان می دهد که این سم دارای سه" دامین "می باشد. دامینI تشکیل شده است از  مجموعه ای از 7مارپیچ آلفا ( (7 alpha-helicesکه برخی یا تمامی آنها این قابلیت را دارند که در درون غشای سلولهای گوارشی مستقر شوند و بدین ترتیب درون غشا منافذی بوجود می آید  که از طریق این منافذ یونها بو طور آزادانه انتقال می یابند و بدین گونه تعادل یونی در دوسوی غشا دستخوش تغییر و تحول می گردد.
دامین IIاز سه" آنتی پارالل بتا شیت" تشکیل شده است که شبیه نواحی" آنتی ژن بایدینگ" "ایمونوگلوبولینها" است. اعتقاد بر این است که عامل اتصال سم به پذیرنده گوارشی دامین II  می باشد.
دامینIII تشکیل شده است از یک توده بسیار پیچیده بتا – ساندویچی که اعتقاد بر این است که این ناحیه از قسمت" C-ترمینال" سم فعال شده در برابر تجزیه شدن توسط پروتئازهای گوارشی در آینده محافظت میکند. جالب آن است که این ساختار  سم BTمشابهت بسیار زیادی با سم "دیفتری "دارد. 
 





 پیشینه، تولیدات و دامنه تاثیر گذاری روی حشرات میزبان:
BACILLUS THURINGIENSIS اولین بار در سال 1911 میلادی بعنوان عامل پاتوزن پروانه ها و بیدها در استان THURINGIA آلمان  کشف و معرفی گردید.
این باکتری برای اولین بار بعنوان حشره کش تجاری درسال 1938 میلادی در کشور فرانسه مورد استفاده قرار گرفت و سپس در سال 1950 میلادی در ایالات متحده آمریکا به کار برده شد.
در آن زمان گونه های بسیار پاتوزن از سویه های باکتری کشف شده بود و توسط ذرات فعالبر ضد گونه های مختلف حشرات به کار گرفته شد.
برای چندین سال متمادی تنها BT برایث کنترل فلس بالان مفید و مورد استفاده بود. در حال حاضر سویه بسیار قوی دیگری به نام B.T VAR KURSFAKI مورد استفاده قرار میگیرد.  
این سویه تا کنون یکی از مهمترین سویه ها برای ساختن BT است.
 در ادامه روند مطالعات بر روی این باکتری آزمایش از تعدادی از سویه های دیگر BT برخی از این سویه هاکه بر علیه لارو سوسک ها ((BEETLES و همچنین دوبالان مانند پشه ها (DIPTERA) فعال هستند شناسایی گردید.
اغلب گونه ها دارای ساختارهای پایه و مشابه ای از سم هستند اما تفاوت آنها در دامنه تاثیر گذاری آنها بر روی طیفهای مختلف حشرات است. شاید دلیل این موضوع وجود درجات مختلفی از تمایل سم برای باند شدن به گیرنده های سم در دستگاه گوارش حشرات باشد.بعنوان مثال سمی که توسط B.T VAR AIZAVAI  تولید می شود اپر بسیار مختصرتری از سمی که توسط B.T VARKURSFAKI  تولید می شود دارد و اثر آن تنها مختص فلس بالان(LEPIDOPTERA ) است و برروی حشرات دیگر اثری ندارد.
بسیاری از سویه های تجاری که جهت کنترل فلس بالان مورد استفاده قرار می گیرند دارای نامهای تجاری خاصی هستند مانند:" بیوبیت " (BIOBIT) ، "دی پل" (DIPEL) و"جاولین" JAVELIN)).
همچنین سم تولید شده توسط گونه ای از BTبه نام گونه اسرائیلی بر علیه حشرات سیاه سیمیولا که آفت نواحی گرمسیری محسوب می شوند و بر علیه قارچها و لارو دوبالان و برخی از گونه های پشه ها بسیار پاتوژنیسیته بالایی دارند.(مخصوصا گونه های AEDES  ، اما بالاترین دوز از توکسین برای کنترل پشه ها(CULEX) و پشه های آنوفل مورد نیاز است.
نامهای تجاری این محصولات عبارتند از: اسکیتال ((SKEETAL -وکتوباک(VECTOBAC) - ماسکوتو(MOSQUITO ATTACK)
همچنین سویه های B.T VAR SANDIGO و B.T VAR TENEBRIONIS  برای کنترل آفت کلم بخصوص برای کنترل آفت مهم سوسک سیب زمینی کلرادو مورد استفاده قرار می گیرد.
سموم BT و طبقه بندی آنها:
سویه های باسیلوس تورین جنسیس دو نوع از توکسین را تولید می کنند. انواع عمدع سموم شامل:1 - سم کریستالCRY(CRISTAL) که توسط ژنهای مختلف CRY  کد می شوند که از این عامل در طبقه بندی گونه های مختلف BT استفاده می شود.
2- سم سیتولایتیک CYT((CYTOLYTIC  که در افزایش قابلیت کنترل حشرات موثر واقع می شود.
تا کنون بیش از 50 ژن کد کننده سموم CRY تعیین توالی شده اند .
 
جدول زیر نشان دهنده چگونگی وضعیت طبقه بندی این باکتری در سال 1995 میلادی را نشان می دهد. البته اخیرا طبقه بندیهای دیگری نیز برای این باکتری ارائه شده است.   
 
Gene
Crystal shape
Protein size(kDa)
Insect activity
cry I [several subgroups:
A(a), A(b), A(c), B, C, D, E, F, G]
bipyramidal
130-138
lepidoptera larvae
cry II [subgroups A, B, C]
cuboidal
69-71
lepidoptera and diptera
cry III [subgroups A, B, C]
flat/irregular
73-74
coleoptera
cry IV [subgroups A, B, C, D]
bipyramidal
73-134
diptera
cry V-IX
various
35-129
 various
روشها و خط مشی های جدید برای توسعه گونه ها:
طی سالهای 1980 بود که مشخص شد سموم" CRY" توسط ژنهای پلاسمیدی که به باسیلوس تورین جنسیس انتقال می یابند کد می شوند.در یک گونه منفرد از" باسیلوس تورین جنسیس" 5 یا 6 پلاسمید مختلف می توانند ژنهای سموم مختلفی را کد کنند.
"پلاسمیدها" میان سویه های مختلفBT از طریق مراحلی مالنند " کانجوگیشن" انتقال می یابند . این عوامل به طور وسیعی انتقال یافته و این عوامل بالقوه  عموما در گونه های متعدد ترکیب های متفاوتی از سموم را تولید می کنند.
همچنین BT حاوی" ترانسپوزان" می باشد.( ترانسپوزانها عناصر ژنتیکی قابل تحرک درون ژنها می باشند که می توانند از یک ناحیه از ژنوم جدا شده و  قسمت دیگر آن ملحق شوند. ترانسپوزونها طی تحقیقات خانم باربارا مک کالین کات در آمریکا شناسایی شد . وی در این زمینه موفق به دریافت جایزه نوبل گردید.) تمام خصوصیات بالا باعث افزایش تنوع در تولید سم به طور طبیعی در سویه های مختلفBT می شود و این مسئله زمینه را برای شرکت های تجاری تولید کننده سم بوجود آورده است تا با کاربرد مهندسی ژنتیک گونه های جدیدی که قادرند ترکیبات جدیدی از سموم را تولید کنند بوجود بیاورند.
یکی از اولین تولیدات گونه های تجاری که توسط مهندسی ژنتیک BTتولید شد RAVEN نام داردکه در جهت افزایش قدرت کنترل سوسکهای آفت سیب زمینی در کلرادو تولید شد والبته به خوبی روی کاترپیلار که جزءآفات سیب زمینی، گوجه فرنگی و برخی دیگر از گیاهان هستندتاثیر گذاشته و آنها را نابود می کند.این سویه جدید دارای دو واکنش گر مختلف برای از بین بردن سوسکهای آفت سیب زمینی و همینطور لارو های فلس بالان بود در  کلرادو تولید شد..
یکی از مشکلات بوجودآامده در کاربرد BT برای کنترل و مبارزه با حشرات آفت ایجاد نوعی مقاومت هرمی در آفات نسبت به سموم مختلف بود که بایستی روشهایی برای به تاخیر انداختن روند این نوع مقاومت مورد استفاده قرار می گرفت.این قبیل پایداریها در گونه هایی گه در معرض سم قرار می گیرند به صورت توسعه یافته ودر واقع این اتفاق در عرض یک تا دوسال در کشورهای مناطق حاره که به شکل نامحدود و کنترل نشده ای از این آفت کش استفاده نمودند رخ داد.بنظر می رسد که مبنای این مقاومت از دخیل بودن چندین علت و فاکتور ناشی می گردد.اما با این وجود یافته دلگرم کننده ای که وجود دارد آن است که در اغلب حشرات بندرت پذیرنده 
N"-آمینوپپتیداز "آنزیم گوارشی برای تاثیر سم BT لازم و ضروری است .همچنین هر تغییری که در این چذیرنده رخ دهد گرچه موجب کاهش توانایی جفت شدن و تاثیر سم می گردد اما این تغییر برای خود حشره بسیار زیان آور است،که این موضوع خود یک عامل بالقوه بسیار مناسب در کاهش مقاومت آفات نسبت به سم است.    
مهندسی ژنتیک گیاهان توسط ژن BT :
از سال 1996 میلادی تا کنون تعداد بسیار زیادی از دانه های گیاهان مختلف از گیاهان مختلف از طریق مهندسی ژنتیک حاوی ژن تولید کننده دلتا-اندوتوکسین ازباکتری باسیلوس تورین جینسیس گردیده اند.این دانه ها با نام BT در حال حاضر در ایالات متحده آمریکا در بازارهای تجاری قابل تهیه است.
این دانه های BT شامل دانه های سیب زمینیBT،پنبهBT و لوبیای BT است. (در كشاورزي اكنون گياهان دستكاري ژني شده كه اختصارا GM ناميده مي شوند ( Gene Manipulated) توليد شده اند. يعني با روشهاي مهندسي ژنتيك، ژن مربوط به سموم آفت كش طبيعي را به داخل ژنوم آنها وارد كرده اند و در نتيجه در بافتهاي خود علاوه بر تركيبات و پروتئين هاي معمولي خود، سموم حشره كش را نيز بيان و توليد مي كنند و در اینجا نیزمنظور از دانه های bt دانه های گیاهانی است که توسط تکنیک مهندسی ژنتیک ژن تولید سم باکتری را پس از جداسازی از ژنوم آن بوسیله یک وکتور به ژن گیاه ملحق می نمایند ، بدین ترتیب خود گیاه واجد شرایط تولید سم شده و دیگر نیازی به استفاده مستقیم از باکتری نیست.) این قبیل گیاهان مهندسی ژنتیک شده ، قسمتی از سم فعال CRY را در بافتهایشان تولید می کنند و بدین ترتیب حشراتی را که از دانه های آنها تغذیه می کنند از بین می برند.
اهمیت این تکنولوژی در روابط میان میزبان و آفات است و از این لحاظ توسعه کاربردی این روش ضروری است زیرابدین ترتیب تنها حشراتی که از دانه های این میزبان تغذیه می کنند در معرض سموم BT قرار می گیرند واین احتمال خطر را برای حشرات گونه های دیگر کاهش می دهد.
همچنین استفاده از این روش دامنه تاثیر BT  را بر روی آفات مذکور افزایش می دهد بدین ترتیب که حشراتی که از ریشه گیاه تغذیه می کنند و یا با ایجاد حفراتی در درون بافت گیاه قرار می گیرند از طریق روش اسپری سوسپانسیون BT روی سطح گیاهان از بین نمی روند و این در حالی است که استفاده از مهندسی ژنتیک این امکان را بوجود می آورد که تمام آفات در هر کجای گیاه در معرض سمومBT قرار بگیرند.برای کاهش خطرات زیستی این سم توسعه استفاده از روش مهندسی زنتیک بر روی  دانه های مهم و سوق الجیشی در جهان در حال حاضردر حال انجام است.
چاپ شده در نشریه تخصصی برزگر - نویسنده خودم

پيام هاي ديگران ()        link        یکشنبه ٩ اردیبهشت ۱۳۸٦ - علی اصغر واعظ زاده اسدی

link http://i30.tinypic.com/141trwm.jpg